细菌回复突变试验：

1.取营养肉汤培养基5mL，加入无菌小三角瓶或无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，在（37±1）℃、（115r/min～125 r/min）振荡培养10h～12h至对数生长期，活菌数不少于1×10⁹cfu/mL。融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。

2.在保温的顶层培养基中依次加入样品液0.1ml、新鲜细菌培养物0.1ml和10%S9混合液0.5mL。无活化组加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL。试管内容物混合后铺至最低琼脂营养平板的表面。在培养前待顶层琼脂固化。样品组分别设三个平行皿。

3. 阴性对照组分别加入0.1mL浸提介质和新鲜细菌培养物0.1ml，活化组再加10%S9混合液0.5mL，无活化组加0.2 mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL；阳性对照组分别加入诱变剂0.1mL和新鲜细菌培养物0.1ml，活化组再加10% S9混合液0.5mL，无活化组加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL。阴性及阳性对照组分别设三个平行皿。全部平皿置37℃倒置培养48～72h观察结果。

体外哺乳动物染色体畸变试验：

1、试验分为短期接触组（有和无代谢活化系统）和长期接触组（无代谢活化系统）。短期接触组接触4h，长期接触组接触24h。

2.接触处理：试验前接种一定数量细胞，置于二氧化碳培养箱培养。一天后弃培养液，0.9%氯化钠注射液组加入对照品或供试品、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）以及培养液。0.9%氯化钠注射液浸提液的终浓度为10%。含血清培养基组加入对照品或供试品、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）。全部置于37℃二氧化碳培养箱中。短期接触组接触结束后吸去培养皿中的液体，用PBS清洗细胞3次，加入含血清培养基继续培养。于24h内收获细胞，收获前4h加入终浓度为1μg/mL秋水仙素。阴性对照组和阳性对照组同法制备。

3.收获细胞与制片：消化细胞后加含血清培养液收集细胞。加入0.075mol/L氯化钾溶液低渗处理后，加入固定液（甲醇：冰醋酸，3:1混合）进行固定，固定结束后离心弃上清，加入数滴新鲜固定液滴片，空气干燥后用姬姆萨染液染色。

4.结果评价：在光学显微镜下每一试验组选择300个分散良好的中期分裂相细胞进行染色体畸变分析，记录畸变细胞数。

小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变试验：

1、 接触处理：取生长良好的细胞，调整密度为1×10⁶/mL，无活化系统组取10mL细胞悬液与9mL试验或对照样品以及150mmol/L氯化钾溶液1mL混合；有活化系统组取10mL细胞悬液，加入9mL试验或对照样品以及S9混合液，37℃震摇处理4小时（有和无活化系统）和24小时（无活化系统）。振荡频率为（70～80）r/min。处理结束后离心，弃上清液，用PBS 或不含血清的培养基洗涤细胞2 遍，重新悬浮细胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，并调整细胞密度为2×10⁵/mL。

2. PE₀平板：PE₀（0 天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8 个细胞/mL，接种96 孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6 个细胞/孔），每个剂量作2块板，37℃，5% CO₂，饱和湿度条件下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。

3. PE₂平板：第2d表达培养结束后，按PE₀接种。每天计数细胞密度并保持密度在10⁶/mL 以下。

4. TEF拮抗平板：第2d 表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁴/mL，加入TFT（三氟胸苷，终浓度为3μg/mL），混匀，接种96 孔板（每孔加0.2 mL，即平均2000 个细胞/孔），每个剂量作2块板，37℃，5% CO₂，饱和湿度条件下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。

5. 结果评价：对每块平板计算无集落生长的孔数，对TFT抗性拮抗平板应计算无小集落孔数、无集落孔数。每个剂量组数据求平均数，

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哺乳动物骨髓红细胞微核试验

1.选用50只体重在25～30g范围内的SPF级KM小鼠，分为5组，每个剂量组10只，雌雄各半。

2. 动物染毒采用两次腹腔注射或尾静脉注射，连续2d，即两次染毒间隔24h，第二次染毒后6h取材。注射量为20mL/kg。

3. 用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨。剔除肌肉等组织，擦净血污。剪去股骨两端，暴露骨髓腔。

4. 用注射器吸取0.1mL胎牛血清，冲洗骨髓腔。用冲洗液常规涂片，晾干或烘干。

5. 将干燥的涂片放入甲醇中固定5～10min，将固定过的涂片放入Giemsa 应用液（1份Giemsa储存液：6份1/15mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成,临用现配），染色10～15min，然后用pH6.8 PBS液冲洗，晾干。

6. 在油镜下观察观察计数含微核的嗜多染红细胞（PCE）数以及观察PCE/NCE（写好标签成熟红细胞）的比例。每只动物计数1000个PCE，计算微核细胞率，以千分率表示。试验数据用泊松分布方法进行统计学处理。同时，计数200个PCE，并记数所见到的NCE。

7. 阳性与阴性对照组的操作程序同供试品组。